Заведующий отделом – Солтынская Ирина Владимировна
В настоящее время можно выделить несколько направлений деятельности отдела:
В рамках научно-исследовательской деятельности отдел проводит участвует в работе по двум темам прикладных научных исследований в сфере деятельности Россельхознадзора:
«Разработка методик полуколичественной оценки содержания мясных ингредиентов в пищевой продукции».
Для определения сырьевого состава продукции применяют молекулярно-генетические методики (ПЦР, секвенирование ДНК) в качественном формате исследований, позволяющие устанавливать наличие/ отсутствие мясных ингредиентов. Однако с использованием указанных методик в случае выявления незаявленных в продукции мясных ингредиентов невозможно дифференцировать намеренную фальсификацию другим видом мяса от случайных, технически неустранимых примесей. На текущий момент в РФ законодательно не закреплено понятие технически неустранимой примеси при определении сырьевого состава продукции, и отсутствуют методики количественного определения сырьевого состава продукции, полученной с использованием мясных ингредиентов.
В рамках данной научно-исследовательской работы проводится разработка методик полуколичественной оценки содержания мясных ингредиентов относительно общего содержания мяса в продукте по соотношению ДНК конкретного вида животного и ДНК позвоночных. Такой подход не позволит проводить точное определение мясных ингредиентов, так как содержание ДНК не в полной мере коррелирует с содержанием самого ингредиента - разные ткани (мышцы, кровь, печень, хрящевая ткань) имеют разное содержание ДНК, а также термическая обработка приводит к частичному разрушению ДНК. Но при принятии ряда ограничений в области применения методик (тестирование определенных видов продукции с использованием корректных стандартных образцов) данный подход позволит проводить полуколичественную оценку.
В рамках НИР планируется разработка методик полуколичественной оценки содержания, говядины, конины, свинины в продукции животного происхождения, сырье и полуфабрикатах методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Уже разработана, валидирована и утверждена методика полуколичественной оценки содержания ДНК курицы в мясной продукции, позволяющая исключить детекцию в анализируемых пробах яиц и меланжа. Данные методики будут применяться в рамках программ государственного мониторинга качества и безопасности пищевых продуктов, а также планируется разработка проекта ГОСТ Р на основе данных методик.
«Ветеринарный мониторинг резистентности бактерий к антимикробным средствам и выявление генетических детерминант резистентности из объектов окружающей среды».
Возникновение и быстрое распространение устойчивости к антибиотикам создает угрожающую ситуацию не только в медицине, но и в ветеринарии, животноводстве, пчеловодстве, аквакультуре, при выращивании овощей и фруктов.
Целью части научно-исследовательской работы, выполняемой в отделе молекулярной биологии, является изучение генетических особенностей и механизмов резистентности изолятов зоонозных бактерий, таких как Salmonella, Escherichia coli, Campylobacter, Enterococcus и др., выделяемых от животных, объектов окружающей среды, из продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также исследование целых бактериальных сообществ (например, кишечника животных, объектов окружающей среды и т.п.).
Исследования проводятся на биоматериале от продуктивных животных, пробах с объектов окружающей среды (сточные воды животноводческих и птицеводческих предприятий, подстилка, смывы с клеток и оборудования и др.), пробах сырья и продукции животного происхождения, поступающих в ФГБУ «ВГНКИ» и подведомственные Россельхознадзору учреждения в рамках государственного мониторинга качества и безопасности пищевой продукции и кормов, а также в рамках эпизоотического мониторинга.
Исследования проводятся как классическими молекулярно-генетическими методами (ПЦР, секвенирование фрагментов генома), так и методом массового параллельного секвенирования полных геномов изолятов бактерий и метагеномных образцов.
Данные полногеномного секвенирования позволяют идентифицировать не только хромосомные мутации, обеспечивающие резистентность, например, к фторхинолонам, но и уточнить локализацию генов антибиотикорезистентности в составе мобильных элементов, обуславливающих горизонтальный перенос генов между таксономически и экологически отдаленными микроорганизмами, например, между микробиомами сельскохозяйственных животных и птицы и микробиомом человека. По результатам НИР в геномах мультирезистентных изолятов E. coli и S. enterica обнаружены следующие мобильные элементы:
- Плазмиды, например, у сальмонелл конъюгативная pESI-подобная плазмида, имеющая глобальный характер распространения;
- Интегроны 1 и 2 классов;
- Транспозоны, в том числе композитные, локализованные как в плазмидах, так и в хромосомах.
Кроме того, для ветеринарной сферы в настоящее время актуальна проблема отсутствия на рынке диагностических систем для экспресс-выявления наиболее часто встречающихся генетических детерминант резистентности. Существующие в настоящий момент отечественные тест-системы ориентированы главным образом на клинический материал от человека. В рамках НИР будут разработаны эффективные ПЦР-методики для выявления наиболее часто встречающихся генов резистентности к основным используемым в ветеринарии и важным для медицины группам антибиотиков. Уже валидированы и утверждены методики выявления генов, кодирующих β-лактамазы CTX-M и CMY типов и гена устойчивости к колистину mcr-1 у бактерий семейства Enterobacteriaceae. Разработанные методики позволят проводить экспресс-выявление генетических детерминант резистентности без предварительного изолирования чистых культур микроорганизмов и могут быть использованы для мониторинга резистентности бактерий к антимикробным средствам ветеринарного назначения.
Для наиболее подробного описания спектра генов антибиотикорезистентности и их распространенности в рамках НИР также планируется их изучение на уровне конкретных микробиомов (в объектах окружающей среды, связанных с животноводством, в кишечнике животных и птиц из различных хозяйств и т.п). Метагеномный анализ, в отличие от исследования генетических детерминант резистентности выделенных чистых бактериальных культур, позволяет оценить качественный и количественный состав пула генов антибиотикорезистентности для конкретного бактериального сообщества, получить полное представление об их уровне распространения в данной бактериальной популяции. Наиболее перспективным в этом направлении является использование таргетного секвенирования, основанного на обогащении целевых участков генома (например, с помощью ПЦР) с последующим проведением массового параллельного секвенирования.
Ранее в рамках НИР 2016-2018 «Разработка методик для выявления и идентификации целевых генов и новых регуляторных последовательностей генно-инженерно-модифицированных организмов» в отделе были разработаны и валидированы девять методик и методических рекомендаций для выявления, идентификации и количественного определения содержания ГМО растительного происхождения. Данные методики позволяют реализовать комплексный подход к ГМО-анализу наиболее значимых сельскохозяйственных (сои, кукурузы, рапса) и продовольственных (рис, картофель) культур. На основе разработанных методик были оформлены национальные и межгосударственный ГОСТы, в частности ГОСТ Р 58958-2020 «Продукция пищевая, сырье, корма и кормовые добавки, посевной материал. Выявление ГМО методом скрининга с исследованием наборов генетических элементов в зависимости от видов сельскохозяйственных растений», устанавливающий алгоритм применения матричного подхода к интерпретации результатов скрининговых исследований на наличие ГМО методом ПЦР.
Кроме того, ранее для совершенствования системы контроля качества мясной и рыбной продукции разработана методика определения видовой принадлежности мяса животных и рыб в однокомпонентной продукции, основанная на секвенировании по Сэнгеру участка митохондриального генома в области гена CytB и сравнении полученной нуклеотидной последовательности с известными последовательностями из баз данных. Данная методика подходит для идентификации тканей млекопитающих, пресмыкающихся и рыб и используется для проведения рутинных исследований в соответствии с областью аккредитации ФГБУ «ВГНКИ» (http://www.vgnki.ru/myaso-i-myasnaya-produkciya.html, http://www.vgnki.ru/ryba-i-rybnaya-produkciya.html). На основе методики разработан ГОСТ 34106-2017 «Продукция пищевая и сырье. Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции».
Также проводились исследования по возможности использования технологии массивного параллельного секвенирования для установления ингредиентного состава многокомпонентной продукции, предусматривающей исследование нескольких фрагментов генома рыб разной длины. Была разработана методика видовой идентификации рыбной продукции на основе технологии массивного параллельного секвенирования пригодная для исследования образцов как однокомпонентной, так и многокомпонентной рыбной продукции, в том числе образцов с высокой степенью деградации ДНК.
В рамках НИР по разработке современных требований и правил мониторинга качества спермы быков-производителей по эпизоотическим, генетическим и репродуктивным параметрам в отделе молекулярной биологии были разработаны методические рекомендации по идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями крупного рогатого скота. Молекулярно-генетические методики позволяют выявить носителей двадцати двух наследственных заболеваний среди животных голштинской, симментальской, абердин-ангусской, бурой швицкой пород.
В рамках своей производственной деятельности отдел участвует в выполнении государственных работ:
- проведение лабораторных исследований сырья, продукции животного происхождения, кормов и биологического материала в целях обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов (видовая идентификация мясной и рыбной продукции);
- ведение и пополнение Всероссийской коллекции клеточных культур, штаммов вирусов, микробов и микропатогенов (молекулярно-генетическая паспортизация штаммов коллекции);
- лабораторные исследования по идентификации возбудителей инфекционных болезней животных, направленные на обеспечение охраны территории Российской Федерации от заноса из иностранных государств и распространения болезней животных.
Кроме того, сотрудники отдела участвуют в испытаниях наборов для проведения ПЦР-диагностики и в диагностических исследованиях методом ПЦР. Также методом секвенирования фрагментов геномов проводится генетическая идентификация вакцинных и производственных штаммов микроорганизмов, типирование штаммов и полевых изолятов различных возбудителей инфекционных болезней животных.
С апреля 2016 года отделом открыто направление по производству наборов реагентов для осуществления всех этапов ГМО-анализа. На сегодняшний день реализуется одинадцать различных тест-систем для выявления, идентификации и количественного определения ГМО методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» (http://vgnki.ru/nabory-reagentov.html).
В рамках иной приносящей доход деятельности разработаны и внедрены в практику Клинико-диагностического центра ФГБУ «ВГНКИ» тридцать шесть молекулярно-генетических тестов для выявления предрасположенности к наследственным заболеваниям, для определения окрасов, групп крови и особенностей экстерьера кошек и собак, также двадцать два теста для выявления носителей наследственных заболеваний среди КРС голштинской, симментальской, абердин-ангусской и бурой швицкой пород (http://vgnki.ru/geneticheskie-testy1.html, http://vgnki.ru/issledovanie-geneticheskogo-materiala-spermoprodukcii.html).
Еще одним направлением деятельности отдела молекулярной биологии является учебно-методическая работа. Сотрудники отдела разработали основы учебного курса «Выявление, идентификация и количественное определение ГМО в продукции растительного происхождения, кормах, семенах и посадочном материале», направленного на внедрение эффективных подходов к проведению исследований на наличие ГМО, изучение методик анализа ГМО растительного происхождения и алгоритма интерпретации полученных данных (http://vgnki.ru/laboratornaya-deyatelnost.html).
Создание лаборатории молекулярно-генетических технологий
В рамках реализации исследовательской программы по теме «Создание комплекса средств защиты против экономически и социально значимых болезней животных на основе отобранных методами геномного секвенирования производственных штаммов микроорганизмов» в рамках федерального проекта «Развитие масштабных научных и научно-технологических проектов по приоритетным исследовательским направлениям» национального проекта «Наука и университеты» (Соглашение о предоставлении субсидии № 075-15-2021-1054 от 29.09.2021г.) 01 ноября 2022 года в ФГБУ «ВГНКИ» была создана лаборатория молекулярно-генетических технологий.
Задачами лаборатории являются проведение молекулярно-генетических исследований с целью изучения генетической структуры и особенностей, а также идентификации микроорганизмов для создания иммунобиологических средств профилактики социально-значимых болезней животных, а также проведение научных исследований и разработок с целью развития методической и научной базы для изучения генетических особенностей штаммов и изолятов микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней животных. Исследования в лаборатории будут проводиться с использованием, главным образом, метода массивного параллельного секвенирования с последующим биоинформатическим анализом как целых геномов микроорганизмов, так и фрагментов геномов (таргетное секвенирование).
